医师在线2023年11期

多通道实时荧光定量 PCR检测 HPVDNA 的效果观察

黎晓敏 杨德鑫第二作者

广东省佛山市复星禅诚医院 

科室：检验科    邮编:528000 ,

[摘要]目的：  分析多通道实时荧光定量聚合酶链反应（ PCR） 在人乳头瘤病毒 （ HPV）DNA 中的检测效果。方法： 分析临床在 2022 年 6 月至 2023 年的 5092 例采用多通道实时荧光定量 PCR 仪进行 HPV DNA 分型及定量检测的宫颈分泌 物标本， 并收集常见的 8 种高危 HPV 各浓度梯度的标本进行可靠性分析。8 种 高危 HPV  型分别为主要高危型 HPV16、HPV18、HPV56、HPV53、HPV51、 HPV52、HPV58、 HPV39 。结果:  随机重复试验对每个型別的各浓度标本进行 的重复性试验每次扩增均为阳性 ，型別符合率为 100%。结论：  多通道实时荧光 定量 PCR 检测 HPV DNA 可对 HPV 分型进行准确鉴别，有助于为临床针对宫颈

病变实施定量检测和疾病诊断提供指导。

关键词： 多通道实时荧光定量 PCR； HPV DNA； 宫颈病变； 疾病诊断

人乳头瘤病毒（ Human papillomavirus， HPV） 属于乳多空病毒科 A 亚群 内 DNA 病毒， 不但可造成人体皮肤及黏膜上皮细胞感染 ，还可诱发上皮细胞增 殖性病变以及乳头瘤样改变， 高危型 HPV 感染与宫颈癌、癌前病变存在重要关 联[1] 。宫颈病变与宫颈感染患者 HPV 负荷量存在重要关联， 临床可通过检测 HPV 负荷量对患者病情严重程度及疾病类型进行评估[2] 。多通道实时荧光定量 PCR 检测方法为临床实施 HPV DNA  感染的常用手段， 可通过具有不同激发/发 射波长的荧光物质对通用型或者不同特异性探针进行示踪，能够于同一反应管中 检测不同基因型别， 有助于临床早期明确诊断女性人群 HPV 感染， 同时也能够 为临床明确病毒载量以及判断患者预后提供指导[3] 。本次研究选取 40 例在本院 进行 HPV DNA 检测的研究对象 ，研究时间为 2022 年 6 月至 2023 年 6 月 ，观

察和分析多通道实时荧光定量 PCR 在 HPV DNA 中的检测价值， 如下：

1 材料与方法

1.1 标本来源

分析自 2022 年 6 月-2023 年 6 月在本院进行 HPV 分型与定量检测的 527 例阳性分泌物标本 。从常见的八个型别中选取各个型别定量值为 103    104     105

106 107 的标本共 40 个， 重复进行荧光定量 PCR 检测。

1.2 仪器和试剂

ABI7500 荧光定量 PCR 扩增仪， 荧光定量试剂为硕世生物的人乳头瘤核酸

分型检测试剂盒 ，样本要求如下：

（1）  样本类型： 宫颈脱落细胞；

（2）  样本采集： 采样前用棉拭子轻轻擦拭宫颈口过多的分泌物， 将宫颈 采样刷伸入宫颈口鳞柱上皮交界处，顺时针或逆时针旋转 3-5 圈采集宫

颈脱落细胞 ，将其放入标有病人编号的取样管中， 密闭送检。

（3）  样本保存和运输：样本采集后应及时检测 ，2℃-8℃保存 3 天内完成 检测，-20 士 5℃保存不超过 12 个月。样本避免反复冻融，冻融次数不

能超过 5 次。

1.3 方法

对所选标本实施多通道荧光定量 PCR 检测 。从-80 冰箱取出收集的标本后  于室温下复溶，于 72h 内实施 DNA 提取，将标本置于震荡器上震荡并使标本混  匀，取 1mL 并置于离心管中，离心速度：13000r/min、半径：8cm、时间：10min， 弃除上清液取沉淀物， 将 50μL DNA 提取液加入至沉淀物中， 然后震荡混匀 。 于 100℃金属浴， 时间： 10min， 转速： 13000r/min， 时间： 5min， 完成离心

后， 上清液即为所需要用到的核酸。试剂则按照试剂盒说明书进行合理分配。

主要以人乳头瘤病毒基因组 L1 区为靶区域， 设计 21 个型别特异性引物和 探针 ，分别以 FAM、HEX、ROX 标记相应型别 ，探针为包括了 5’端报告基团和 了 3’端淬灭基团的寡核昔酸 ，在 PCR  扩增过程中 ，当探针完整时， 由于淬灭基 团轮近报告基团，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，不发出荧光信号。引物 延伸时， 与模板结合的探针被 Tag 酶（ 5'->3-外切核酸酶活性）切断， 报告基 团与淬灭基团分离 ，产生荧光信号， 荧光定量 PCR 仪根据检测到的荧光信号自 动绘制出实时扩增曲线，从而实现对人乳头瘤病毒在核酸水平上的定性检测。同 时参考基因可以用于监控并排除由于仪器故障、试剂因素、操作不当或样本中的 抑制物等因素造成的假阴性结果。配完试剂后加入备好的核酸溶液 2ul 于反应孔

中并应用实时荧光定量 PCR 进行检测， 分别实施阴性阳性对照孔检测。

热循环条件设置， 如下 50℃5min 进行 UNG 酶处理， 95℃预变性 10min ， 95℃变性 10s,58℃退火延伸 40s ，共 45 个循环。荧光采集阶段在 58℃,40s ，选 择的检测通道为 FAM、 HEX、 ROX、三个通道进行检测， 循环参数设置完毕 ， 进行样本参数设置，然后进行 PCR 扩增。扩增完毕后根据内标值的 CT 值和目标 基因的 CT 值进行公式换算 ，可得到目标基因的阳性定量值 。这个需要用到试剂 公司提供的软件。通过对每个型别的各浓度标本进行重复性试验，以观察该试剂

的重复性。

1.4 观察指标

分析高危型 HPV16、HPV18、HPV56、HPV53、HPV51、HPV52、HPV58、 HPV39 各浓度检出的定量值与原始的定量值对比， 计算标准差及变异系数， 来

判断试验的重复性。

多通道荧光定量 PCR 检测共计检出阳性患者 527 例 ，总检出率达 10.35%。 HPV16 占总阳性标本 9.11%， HPV18 占 4.74%， HPV56 占 5.69%， HPV53 占  9.30%， HPV51 占 7.21% ， HPV52 占， 16.89%，  HPV58 占 8.53%，  HPV39

占 5.50%。

各浓度重复性试验