药物与人2023年11期

磷钼蓝分光光度法在残留检测中的应用

吴美芳 屠宝英 童陈惠

广东华润顺峰药业有限公司   广东省   佛山市528300

摘要：目的：为磷酸二氢钙粉碎后的残留物清洗和检测提供参考。方法：参考GB/T 5750.5-2006

《生活饮用水标准检验方法 无机非金属指标》中磷酸盐的检测方法，制定不锈钢表面磷酸盐残留取样回收率的检测方法，并对原方法提出优化建议[1]。结果：磷酸盐标准品检测浓度在0μg·ml-1~2.0μg·ml-1范围内与吸光度呈良好线性关系（r2=0.999），平均回收率97.5%（n=6)，RSD为1.07%。结论：本方法操作简便、结果准确，专属性强，重复性好，可用于磷酸盐的残留检测[2]。

关键词：磷酸盐；磷钼蓝分光光度法；含量测定

磷酸二氢钙是生产片剂的常用辅料，本品通常需要粉碎处理。本品粉碎后会残留在设备表面，且较难清洗干净。本实验拟增加清洁剂10%磷酸溶液进行清洁，使用10%磷酸溶液清洁后再用水清洁。根据化学反应式CaHPO4+H3PO4=Ca(H2PO4) 2，将产生副产物磷酸二氢钙，所以设备表面将可能存在磷酸二氢钙、磷酸氢钙和磷酸等物质[4]。为了在最大限度地降低片剂生产过程中污染、交叉污染以及混淆、差错等风险和确定清洁完成后磷酸盐的残留能否达到接受的限度，要对设备清洁完成后磷酸残留进行残留检测。本次实验研究采用磷钼蓝分光光度法，用于测定磷酸盐的残留量。本法的特点是可用于生产设备中磷酸盐的残留检测。

1.   仪器与试药

1.1 仪器

Starious十万分之一天平（厂家：赛多利斯科学仪器公司；型号：CPA225D）；

紫外-可见分光光度计（厂家：岛津；型号：UV-2600）；

1.2 试药

磷酸（级别：分析标准品 厂家：阿拉丁；批号：G2114290）

磷酸氢钙（级别：AR 厂家：麦克林；批号：C12592158）

磷酸二氢钾（级别：AR 厂家：广州化学试剂厂；批号：20210701）

钼酸铵（级别：AR 厂家：广州化学试剂厂；批号：20160401-1）

硫酸（级别：AR 厂家：广州化学试剂厂；批号：20220604）

氯化亚锡（级别：AR 厂家：天津市福晨化学试剂厂；批号：20180107）

盐酸（级别：AR 厂家：广州化学试剂厂；批号：20220206）

2.   方法与结果

2.1  光谱方法

照紫外-可见分光光度法（中国药典2020年版四部通则0401），在700nm的波长处，测定吸收度[3]。

2.2  溶液制备

2.2.1   磷酸盐标准溶液[p(PO43- )=0.01 mg/ mL]:精密称取磷酸二氢钾0.1430g,置1000ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀。吸取10.00mL,用水准确定容至100 mL。            

2.2.2   钼酸铵-硫酸溶液:向约70 mL纯水中缓缓加入28 mL硫酸,稍冷,加入2.5g钼酸铵.待固体完全溶解后,用纯水稀释至100mL。

2.2.3   氯化亚锡溶液(50 g/ mL)：加热溶解5 g氯化亚锡(SnCl2· 2H2O)于5 mL盐酸中,用纯水稀释至100 mL.此试剂不稳定,需现用现配。

2.2.4   模拟磷酸盐标准溶液[p(PO43- )=0.05 mg/ mL]：精密称取磷酸0.7739g和磷酸氢钙0.3582g，置称量舟中，用纯水完全洗入1000ml容量瓶，振摇使溶解，并加水稀释至刻度，摇匀。精密量取5 mL，至100mL容量瓶中，加水定量稀释至刻度，制成含磷酸盐为0.05 mg/ml的溶液，作为模拟磷酸盐标准溶液；

2.3  方法学考察

2.3.1   波长选择

      吸取磷酸盐标准溶液5.00 mL，置于50 mL比色管中,加纯水至50 mL,加入4 mL钼酸铵硫酸溶液,摇匀。加入1滴氯化亚锡溶液，再摇匀。并用空白溶剂按同法制备作为参比溶液。于400 nm~800 nm波长范围内扫描，本品在约700nm处有最大吸收。

2.3.2   绘制标准曲线

分别吸取磷酸盐标准溶液0 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL.4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL.10.00 mL,置于50 mL比色管中,加纯水至50 mL,加入4 mL钼酸铵硫酸溶液,摇匀。加入1滴氯化亚锡溶液，再摇匀,20 min后于700 nm波长处测其吸光度，绘制标准曲线。 结果表明磷酸盐在检测浓度0μg·ml-1~2.5μg·ml-1范围内与吸光度呈良好线性关系，得回归方程y =0.2319x-0.0057, （R²=0.9994）,结果见表1。

表1 磷酸盐标准曲线

2.3.3   模拟磷酸盐标准溶液的线性考察

2.3.4   分别吸取供试品溶液0.50 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL、2.00 mL置于50 mL比色管中,加纯水至50 mL,加入4 mL钼酸铵硫酸溶液,摇匀。加入1滴氯化亚锡溶液，再摇匀,20 min后于700 nm波长处测其吸光度，绘制标准曲线。结果表明模拟磷酸盐标准溶液在检测浓度0.5μg·ml-1~2.0μg·ml-1范围内呈良好线性关系，得回归方程Y=0.2382X-0.0208, （R²=0.9993）。结果见表1。

表1 磷酸盐标准曲线

吸取磷酸盐标准溶液5.00 mL，置于50 mL比色管中,加纯水至50 mL,加入4 mL钼酸铵硫酸溶液,摇匀。加入1滴氯化亚锡溶液，再摇匀。并用空白溶剂按同法制备作为参比溶液。在20 min后于700 nm波长处测其吸光度，同一样品溶液连续测定7次，平均吸光度为0.211，RSD为1.06%（n=7)。表明仪器精密度良好。2.3.5   精密度试验

2.3.6   准确度试验：

分别吸取磷酸盐标准溶液2份各5.00 mL、7份模拟磷酸盐标准溶液1.00 mL，分别置于50 mL比色管中,加纯水至50 mL,加入4 mL钼酸铵硫酸溶液,摇匀。加入1滴氯化亚锡溶液，再摇匀,在20 min后于700 nm波长处测其吸光度，并用空白溶剂按同法制备作为参比溶液。7个样回收率分别为98.2%、98.2%、98.2%、95.4%、97.3%、97.3%、98.2%；平均回收率为97.5%，RSD为 1.07%。说明该方法的准确度良好。

2.4  棉签擦拭回收率试验

2.4.1   以10ppm标准限度残留限度计算方法，擦拭取样面积10×10cm2=100 cm2，残留量限度：约50µg。

2.4.2   第一步：制备污染环境

在清洁的不锈钢板上标记10cm×10cm的方块，精密量取1mg/ml模拟磷酸盐标准溶液0.05ml，在每一块10cm×10cm的方块中尽量均匀地涂布在区域内，在通风橱内放置至溶剂完全挥干。

用空白溶剂制备空白溶液。

2.4.3   第二步：取样

将棉签用水润湿，但尽量要挤干水，在100cm2的方块中擦拭，过程中要求取样框范围内都要擦到。完成擦拭的棉签放入50ml比色管。

2.4.4   第三步：提取、分析

每份棉签擦拭样品中分别加水约25ml，超声5分钟，摇匀，小心取出棉签，用约20ml水分三次淋洗棉签，每次淋洗后尽量挤干棉签的水，淋洗液和挤出的水并入50ml具塞试管中，最后加水补充至50ml刻度线，摇匀。（含磷酸盐1μg/ml）

照上述光谱条件，对擦拭样品溶液进行分析，记录样品及空白对照响应值。计算每块表面上磷酸盐的含量及取样回收率。结果显示，每个样品回收率分别为100.7%、100.6%、101.1%、99.8%、100.2%、100.1%，RSD为0.5%。

3.   讨论

3.1.     显色后测试时间点的选择

配制对照品溶液和样品溶液，按仪器工作条件在室温放置60分钟，每隔10分钟按2.1的光谱条件测定吸光度，数据显示在10分钟吸光度达最高值，但吸光度在20-40分钟内比较稳定，40分钟后吸光度明显降低。所以本品在显色后20min~40min内溶液稳定。GB/T 5750.5-2006中的方法是10分钟后检测，我们认为10min时虽然吸光度最大，但数值尚未稳定，20min时吸光度有较为明显的回落，但20min~40min内数值稳定，磷酸盐残留检测通常样品数量较多，很难控制都在10min时检测，所以选择在显色后20min~40min内测定。

3.2.     制备污染环境时污染物的选择

由于生产用的辅料为磷酸二氢钙，如果以磷酸盐标准溶液为污染物，就会带入新的离子钾离子。为了不带入新的污染物，选择用磷酸二氢钙来配制污染物，但磷酸二氢钙微溶于水，不能配制成需要的浓度溶液。根据相似相溶的原理，加入磷酸可以增强磷酸二氢钙的溶解性。实验证明 以磷酸二氢钙：磷酸的PO43-为1：1或1：2进行溶解时，磷酸二氢钙不能完全溶解，但磷酸二氢钙：磷酸的PO43-为1：3时，，磷酸二氢钙能完全溶解。这里不能纯磷酸的目的是为了尽可能与生产环境一致。

参考文献

[1]GB/T 5750.5-2006《生活饮用水标准检验方法 无机非金属指标》

[2]GBT9727-2007磷酸盐检测通用方法

[3]国家药典委员会，中国，中华人民共和国药典（ChP）2020年版 9101分析方法验证指导原则

[4]美国注射剂协会（PDA）TR29 清洁验证考虑要点，2012年